生物细胞作用例1

micrornas(mirnas)是一些长度为21-25个核苷酸，在转录后水平调控基因表达的非编码的小rnas。mirnas最早的两个成员是在研究c.elegans的发育调控时发现的。自此，在几乎所有的后生动物如涡虫，果蝇，植物，哺乳动物的基因组中都发现了mirnas[1]。它们主要作用于mirna，使其发发生特异性地降解或者阻止其翻译，从而调控动植物的发育和生理过程。

干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的早期未分化细胞, 不仅是器官发生过程中早期分子活动的研究工具, 且已成为多种退行性疾病组织修复和再生的种子细胞。www.133229.CoM由于干细胞具有广泛的应用前景, 相关的发育分化模型的建立、干细胞发育分化的基因调控及微环境的影响, 已成为近年来医学和生物学领域研究的热点。mirnas作为一个广泛存在的可对基因表达进行调控的分子, 在动植物的发育和生理活动中起着非常重要的作用，包括抵御病毒，在发育中调控基因的表达，控制发育的阶段，维持干细胞的稳定等等。mirnas在干细胞中的特异性地表达，尤其在胚胎干细胞和造血干细胞中相关mirnas的发现、功能的研究, 揭示了mirnas 可能在干细胞的自我更新和多项分化中发挥重要作用。

1mirna和干细胞的研究

mirna是一类～22 nt具有调控功能的非编码rna ，它们主要参与基因转录后水平的调控。这些mirna 基因首先在细胞核内转录成前体转录本(primary transcripts mirna, primirna) ，在drosha酶的作用下剪切形成～60-70nt的mirna前体（或者称为premirna），然后ran–gtp和exportin 5将premirna转运到细胞质，随后，另一个核酸酶dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的mirna:mirna*双链。这种双链很快被引导进入rna诱导沉默复合体(risc)中，其中一条单链mirna被降解，另一条成熟的单链mirna分子，通过与靶基因的3′ utr区互补配对，对靶基因mirna进行切割或者翻译抑制[2]。mirna具有如下特点[3-5]：①细胞特异性：不同组织不同细胞，mirna的表达谱及序列特征不同，这可以作为某些组织或细胞的特异性分子标志； ②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，mirna 组成不同，在特定细胞的特定阶段“出现”特定的mirna ，决定细胞的分化方向和分化时相，是细胞定时、定向分化的开关； ③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同或相似的mirna分子具有相似的调控功能；④mirna作用靶点：多为呈“时空”特异性表达的转录调控基因以及凋亡调控基因，通过调控细胞增殖和细胞凋亡，从而调控细胞功能和结构的特化。

干细胞具有多向分化潜能，它如何从一个充满各种可能性的通用细胞类型演变成从事特定工作的“专业”细胞，是干细胞研究的谜题。 近年来，mirna 在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现，目前已经掀起mirna在干细胞研究中的热潮。

目前发现胚胎干细胞和多种成体干细胞中均存在各自特异的mirna。houbavity等[6]在小鼠胚胎干细胞中克隆了15个mirna ,suh等[7]则在人胚胎干细胞中找到了36个mirna基因，这些mirnas多数在胚胎发育过程中逐渐减少，少数持续表达甚或表达升高。随着细胞的分化，mirnas的表达也发生了明显的改变。mirnas和mirnas的相互作用对于维持干细胞的多能性及其分化非常重要。因此许多试验希望可以通过分析人胚胎干细胞中的mirnas的表达来描述人的胚胎干细胞。

2 mirna对干细胞生物学行为的调控

2.1 mirna调控了干细胞的自我更新

自我更新是干细胞的一个重要特征，从这个层面来说，干细胞与肿瘤细胞一样都可以持续分裂。 因此，如何调节恰当的细胞分裂，使其不会因为太少导致组织发生缺陷，又不至于过分增殖恶化为肿瘤，是干细胞生物学研究的一个攸关问题。

在多能胚胎干细胞中，有特殊mirna的簇集表达，这些mirna明显区别于分化之后的胚胎和成体[7]，暗示这些mirna对于干细胞的自我更新具有一定作用。决定细胞继续增殖还是停止分裂或分化，在g1期由周期依赖性蛋白激酶抑制子p21所调控[8] 。

有研究者通过使用果蝇胚胎作为模型系统，证明了mirna1有助于早期胚胎阶段的心脏祖细胞（即干细胞）的决定。mirna1有助于维护末期胚胎阶段中的心脏前体，可以调节心脏细胞的分化机制。这都说明mirnas调控了干细胞的自我更新。

另外，dicer酶对于胚胎的发育和干细胞的维持是必不可少的。dicer敲除的突变体在发育早期胚胎是致死的，在dicernull的胚胎中，根本检测不到es细胞系[9]；dicer缺陷的“escaper”和dicerflox/null 细胞相比，细胞周期发生了改变，g1期和g0期的细胞有了轻微的增加，相应地，g2期和m期的细胞减少。这种现象可能是由于本应该在es细胞中表达的抑制细胞周期抑制子的mirnas的缺失导致的。基因组的组成和结构也受到了影响从而激发了细胞周期检验点的反应，阻止了细胞的进一步增值[10]。

mirnas对于果蝇的gscs的分化的控制是必不可少的。果蝇基因组中有两种dicer异构酶：dicer1和dicer2[9]。dicer1对于干细胞的加工是必需的，而dicer2是形成sirna所必需的。dicer1(dcr1)的缺失完全破坏了mirna途径，但对sirna途径的影响是非常微弱的。分析gscs的dcr1突变体发现，生殖细胞孢囊的产量明显下降。gscs的dcr1的突变体看起来是正常的，但是在细胞周期控制方面存在明显的缺陷。根据细胞周期标记物和一些遗传的相互作用的研究发现，gscs的dcr突变体推迟了g1到s期的转换。干细胞对外界的信号非常敏感，比如营养依赖的胰岛素受体活化可以使干细胞停滞在g1/s 期。胚胎干细胞是通过mirna通路来调节p21/p27/dacapo 对cdk的抑制作用从而使自身停滞在g1/s期。当外界环境不利于干细胞分裂时，关键的mirna被下调，p21/p27/dacapo的水平上升，从而导致干细胞停滞在g1/s 期[11]。但是，参与此过程的具体mirna是哪些，至今仍未有报道，更深入的机制仍需研究。对于成体哺乳动物干细胞是否有类似的mirnap21调节机制以及是否依赖于环境因素，也还需要更多的实验证实。

2.2 mirna参与神经干细胞的分化调控过程

神经系统是一个高度分化的器官，在已经鉴定的mirnas中，约有70％可以在哺乳动物的脑中检测到，说明了这些mirnas在神经发生中可能的作用[12]。对哺乳动物脑发育过程中高度表达的mirnas的研究表明，在发育起始的mirnas和特异性分化后表达的mirnas有显著的不同[13]。前体细胞顺序表达一系列mirnas，在分化过程中发生了特异性的表达。例如小鼠胚胎干细胞中的mirna124a 和mirna9特异性地决定神经干细胞的发育形成, 并且初步推测可能是通过作用于stat信号转导通路发挥作用[14]，mirna23，mirna26和mirna29的上调表达导致分化形成神经胶质，而mirna9和mirna125在神经元和神经胶质细胞中均有表达。let7家族成员也高度存在于神经系统中。在斑马鱼的神经组织和老鼠的发育过程中[41]，let7家族成员都是高度表达的。在神经分化过程中，通过转录激活和增强前体物的加工活性可以显著诱导let7家族成员的成熟，这表明了let7在神经特异分化中的作用[15]。

预测还发现，在成年的哺乳动物中，含量最为丰富的是mirna124，有1100多个基因的结合位点。将mirna124导入hela细胞中，可以下调100多种基因的表达[16]，并且促进了神经样mirna的表达。最近，在鸡的神经管中发现层粘连蛋白gammal和整合素betal1也是mirna124的作用位点。而且，mirna124可以和小的c端结构域磷酸酶1（scp1）的3’utr结合，这种磷酸酶在神经发育过程中起着重要作用。识别神经系统中mirna的靶序列对于我们更好地了解神经干细胞的自我更新和分化是非常重要的。

2.3 mirna调控造血干细胞的发育

造血干细胞定向分化潜能受mirna调控，在各系祖细胞中高表达mirna可能起着定向分化调控作用。chen等[17]在小鼠的骨髓造血细胞中克隆了100个特异的mirna ,并已确定一些mirna在造血组织中优先表达, 如mirna142在b淋巴细胞和髓系粒细胞中表达增高，mirna181在b淋巴细胞中选择性表达上调，其中，mirna181在骨髓祖细胞阴性谱系中高水平表达并只在b淋巴细胞中上调，在体内和体外mirna181的过表达可提高b细胞的数量，表明mirna181可能是b细胞分化中的一个正调节因子，参与造血干细胞向b细胞谱系的分化。

felli 等[18]发现，在脐血cd34 +造血祖细胞向红系发育过程中，mirna221和222表达逐渐下降。这2个mirna作用于kit基因的3′utr，在cd34 +细胞中转染mirna221和222的寡核苷酸或者慢病毒表达载体，可导致红系增殖和分化障碍，伴随kit蛋白水平下降。nodscid小鼠体内实验表明，转染后cd34+细胞的增殖能力和干细胞功能受损；反之，阻断mirna221和222表达，则促进早期红系增殖。实验表明，mirna221和222的表达下降可促进红系发育。

最近发现，mirna还调控了造血干细胞自我更新[19] 。造血干细胞能够制造对分化成血细胞至关重要的蛋白质，但是这些蛋白被1套mirna阻断，将造血干细胞维持在原始状态。利用非增殖病毒载体将mirna转染入造血干细胞，检测造血干细胞的自我更新能力。第1个进行检测的是mirna155，已经被证实能够终止干细胞发育成红血球和白血球，没有转染的干细胞可以发育成熟，而转染了mirna155的干细胞则很少能发育成熟为红血球和白细胞。

3 mirna决定了干细胞的命运

3.1 mirna操纵胚胎干细胞的命运

研究表明两种依赖于血清应答因子（serum response factor,srf）的肌特异mirna1和mirna133，能促进胚胎干细胞的中胚层形成，同时在心肌祖细胞的进一步分化过程中有着不同的作用：mirna1能促进小鼠和人类胚胎干细胞向心脏细胞的分化过程，而mirna133则阻止肌浆蛋白祖细胞的分化，mirna1和mirna133在发育的肌细胞中是同时表达的。mirna1和mirna133是一种强有力的非肌性基因表达的抑制因子，并且能抑制小鼠以及人类胚胎干细胞分化过程中的细胞命运。两种mirna都增加了胚胎干细胞的中胚层特异性，并且抑制它们向内胚层及神经外胚层的分化。

其中，mirna1的作用部分通过notch ligand deltalike 1（dll1）的翻译阻遏实现，mirna1的表达导致dll1的翻译阻遏，并利用shrna降低干细胞中dll1的表达。此外，mirna1和mirna133能强有力的抑制内胚层以及神经外胚层的基因表达，这表明两者之间或许有着很多共同作用目标。对于胚胎干细胞的基因表达分析表明，mirna1和mirna133调节多个相同通路。可见肌特异性mirna能增强非肌性基因的抑制，并且mirna能用于多能胚胎干细胞的细胞命运调节[21]。

3.2 mirna提高了ips的转化效率

自ips出现以来，转化效率一直是横跨在ips技术面前的障碍。有研究表明，将头发里的角质细胞进行重组诱导ips细胞，发现转化效率可提高100倍。最近发现将两种因子p53 sirna和utf1和四个诱导基因（oct4,sox2,klf4和cmyc)一起转染到人成纤维细胞中，ips的诱导效率也可提高100倍，而且，剔除cmyc（具有致癌性基因）同样可以成功诱导ips[22]。

4 展望

不同的干细胞类型表达的mirnas不同，在干细胞的不同发育阶段也存在着特异性的mirnas的表达，我们有理由相信，mirnas在调控干细胞的分化和自我更新方面具有非常重要的作用。mirna作为一种新的调控基因表达的小分子rna，对干细胞的研究提供了一种新的途径。

随着干细胞复杂的分化调控的研究，我们将更好地了解mirnas和一些转录因子的相互作用，从而弄清整个细胞内的调控网络。目前关于mirnas对于干细胞生物学行为调控的研究还很少，mirnas在干细胞中究竟是如何起作用的？它的作用靶位有哪些？关于其调控分化的模型在哺乳动物也成立么？这些问题都有待进一步地探讨。基于多分化潜能和功能谱系不同的干细胞是由遗传和表观遗传共同决定的，作为组织工程的“种子细胞”，弄清它内部的mirnas的作用通路，有助于揭示干细胞发育过程的基因调控。我们的终极目标是希望将mirnas调控干细胞的分化作为一种潜在的治疗手段，以便更好地了解一些特异性的细胞通路中的mirnas，治疗癌症等疾病。

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生物细胞作用例2

inhibitory effects of  5f from pteris semiinnata  l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells

    liu yi1，wu kefeng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lianci1，3

    1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of   hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college

    corresponding authors：liang lianci，email：plliu78@sina.comabstract：objective   to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells. methods  ncih460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pihoechst double staining and tunel assay  were used to observe cell  apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results  5f displayed growth inhibitory activity against ncih460 cells with ic50 values of  21.40,4.52 and 1.02 μg/ml   at the  point  of   24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. ncih460 cells treated by 5f were arrestet   in g2/m. conclusion  in vitro 5f  significantly   inhibited  the proliferation of ncih460 cells and the activity might   be realized through   inducing apoptosis.

    key words：pteris semiinnata l;  5f;  ncih460;  proliferation inhibited

半边旗（pteris semiinnata l.）是生长在我国南方的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。从半边旗中分离提取到一些具有生物活性的物质，以5f含量最高，其结构为二萜类化合物，见图1。化学结构名为11α羟基15氧16烯对映贝壳杉烷19酸（ent11αhydroxy15oxokaur 16en19oic acid）。本课题研究表明5f在体外能抑制多种癌细胞的生长并诱导凋亡的发生；能明显减小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的肿瘤大小，延长小鼠存活时间[13]。

    肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者仅有2%存活率超过5年，通常不满1年。近年来，对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗为主导，这些治疗药物和措施会给患者带来极大的痛苦，因此，从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨5f对非小细胞肺癌ncih460细胞生长的抑制作用及可能的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    从植物半边旗中提取的5f，纯度为100%，使用前溶于dmso。

    mtt、hoechst33342、pi为sigma公司产品；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi1640购自美国hyclone公司；胰酶购自美国gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

    非小细胞肺癌nci－h460细胞由本室传代。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养

    ncih460细胞培养于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l链霉素的rpmi1640培养液中，37℃、5%  co2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。

    1.2.2  mtt法检测5f对ncih460细胞的生长抑制作用

    取对数生长期的ncih460细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi1640完全培养液调制成2.0×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μl（含2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl及不同浓度的5f药液10μl，使终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。同时设置adm阳性对照组，空白对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，立即比色，用elx800型酶标仪在主波长为570nm，参比波长为630处测量od值，比色以空白孔调零。实验重复3次。

    抑制率=（1-实验组8孔od值平均值/对照组8孔od值平均值）×100%。

    bliss方法计算半数抑制浓度ic50。

    1.2.3  荧光显微镜观察细胞形态

    取对数生长期细胞， 调整细胞浓度为2.0×105/ml， 加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中， 24h待细胞爬片后， 加入不同浓度的5f药液， 使其终浓度为5、 10、 20μg/ml， 继续培养24h后， 用预冷的pbs洗涤2次， 加入hoechst33342  37℃染色15min， pbs洗涤2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min,  pbs洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。

    1.2.4  流式细胞仪检测dna含量的变化

    参照文献介绍的方法略加改进，1 000r/min, 离心5min收集药物处理组和对照组细胞，pbs洗涤2次，体积分数为70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs离心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l  pi，10mg/l  rnasea，0.1% tritonx100,  0.1%柠檬酸钠和0.5%nacl),室温下避光染色30min，400目筛网过滤,用epicsxl型(美国)流式细胞仪检测dna含量，实验重复3次。

    1.2.5  细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡

    取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0×105个/ml，加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中，24h待细胞爬片后，加入不同浓度的5f药液，使其终浓度为5、10、20μg/ml，继续培养24h后，用4%多聚甲醛／0.01m pbs室温下固定60min，余下步骤按试剂盒说明书进行操作。

    2  结果

    2.1  5f对ncih460细胞生长的抑制作用

    从表1和图2的结果可以看出，5f能明显抑制ncih460细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用细胞48h后效果与阳性对照药adm相近。5f作用ncih460细胞24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml。

    2.2  荧光显微镜观察5f对ncih460细胞的影响

    经pihoechst双染的ncih460细胞， 对照组细胞核大小较均一， 呈圆形或椭圆形， 染色质分布均匀， 此外光下显蓝色荧光， 出现个别坏死细胞， 见图3a。 而经5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态则出现不同程度皱缩， 变形， 染色质浓缩， 部分细胞核染色体碎裂， 并有凋亡小体出现， 见图3b～d。 且细胞凋亡形态出现的多少与5f的浓度相关。

    2.3  流式细胞仪检测细胞dna的变化

    5f作用细胞24、48h后ncih460细胞的dna含量发生变化。随着5f作用终浓度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出现含量降低，s期表1  5f对ncih460细胞的生长抑制作用表2  5f处理ncih460细胞不同时相dna含量的影响变化不明显，g2/m显著增加。提示5f可以将ncih460细胞阻滞在g2/m期，见表2。

    2.4  tunel法检测5f对ncih460细胞凋亡的影响

    tunel法检测显示正常对照细胞不显深棕黄色,而经5f处理后的细胞胞核呈深棕黄色，表现为形态皱缩,核固缩,凝集成块，并形成凋亡小体，其凋亡数与5f剂量呈正相关，见图4。

    3  讨论

    临床上用于治疗肿瘤的热疗、放疗、化疗及生物疗法一直被用于杀死肿瘤细胞，随着肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈进，尤其近十几年迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望，但目前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺进行了详细的研究[46]，多年的实验证实其二萜类提取物5f 在体外可致人的多种癌细胞死亡，主要作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁移[79]。

    细胞凋亡(apoptosis)是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。凋亡细胞的特征是细胞体积缩小，随即与邻近细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质浓缩呈块、团，典型的为半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结构，内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的[6]。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。

    细胞的生长增殖，24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f对其的生长抑制作用呈浓度－剂量及时间－剂量关系；荧光双染的结果显示经不同浓度的5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，细胞凋亡形态出现的数量与5f的作用浓度有关,这提示5f体外对ncih460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡有关；流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在g2/m期，但5f终浓度为40μg/ml时，细胞周期各时相均出现不同程度的改变，这可能与高浓度5f直接杀伤细胞，表现出细胞毒作用有关；进一步用tunel法进行凋亡检测证实了5f抑制ncih460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示5f具有诱导ncih460细胞凋亡的能力，是一种值得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。

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［7］ 何太平，覃燕梅，莫丽儿，等. 半边旗二枯类化合物sf对高转移卵巢癌ho 8910pm细胞中癌相关基因表达的影响[j]. 中国药理学通报，2008， 24（1）：117122.

生物细胞作用例3

inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of non?small cell lung cancer nci?h460 cells

liu yi1，wu ke?feng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lian?ci1，3

1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college

corresponding authors：liang lian?ci，e?mail：abstract：objective to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of non?small cell lung cancer nci?h460 cells. methods nci?h460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pi?hoechst double staining and tunel assay were used to observe cell apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results 5f displayed growth inhibitory activity against nci?h460 cells with ic50 values of 21.40,4.52 and 1.02 μg/ml at the point of 24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. nci?h460 cells treated by 5f were arrestet in g2/m. conclusion in vitro 5f significantly inhibited the proliferation of nci?h460 cells and the activity might be realized through inducing apoptosis.

key words：pteris semiinnata l; 5f; nci?h460; proliferation inhibited

半边旗（pteris semiinnata l.）是生长在我国南方的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。从半边旗中分离提取到一些具有生物活性的物质，以5f含量最高，其结构为二萜类化合物，见图1。化学结构名为11?α?羟基?15?氧?16?烯?对映贝壳杉烷?19?酸（ent?11α?hydroxy?15?oxo?kaur 16?en?19?oic acid）。本课题研究表明5f在体外能抑制多种癌细胞的生长并诱导凋亡的发生；能明显减小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的肿瘤大小，延长小鼠存活时间[1?3]。

肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者仅有2%存活率超过5年，通常不满1年。近年来，对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗为主导，这些治疗药物和措施会给患者带来极大的痛苦，因此，从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨5f对非小细胞肺癌nci?h460细胞生长的抑制作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

从植物半边旗中提取的5f，纯度为100%，使用前溶于dmso。

mtt、hoechst33342、pi为sigma公司产品；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi?1640购自美国hyclone公司；胰酶购自美国gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

非小细胞肺癌nci－h460细胞由本室传代。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

nci?h460细胞培养于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l链霉素的rpmi?1640培养液中，37℃、5% co2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 mtt法检测5f对nci?h460细胞的生长抑制作用

取对数生长期的nci?h460细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi?1640完全培养液调制成2.0×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μl（含2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl及不同浓度的5f药液10μl，使终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。同时设置adm阳性对照组，空白对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，立即比色，用elx800型酶标仪在主波长为570nm，参比波长为630处测量od值，比色以空白孔调零。实验重复3次。

抑制率=（1-实验组8孔od值平均值/对照组8孔od值平均值）×100%。

bliss方法计算半数抑制浓度ic50。

1.2.3 荧光显微镜观察细胞形态

取对数生长期细胞， 调整细胞浓度为2.0×105/ml， 加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中， 24h待细胞爬片后， 加入不同浓度的5f药液， 使其终浓度为5、 10、 20μg/ml， 继续培养24h后， 用预冷的pbs洗涤2次， 加入hoechst33342 37℃染色15min， pbs洗涤2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min, pbs洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测dna含量的变化

参照文献介绍的方法略加改进，1 000r/min, 离心5min收集药物处理组和对照组细胞，pbs洗涤2次，体积分数为70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs离心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l pi，10mg/l rnasea，0.1% tritonx?100, 0.1%柠檬酸钠和0.5%nacl),室温下避光染色30min，400目筛网过滤,用epicsxl型(美国)流式细胞仪检测dna含量，实验重复3次。

1.2.5 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡

取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0×105个/ml，加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中，24h待细胞爬片后，加入不同浓度的5f药液，使其终浓度为5、10、20μg/ml，继续培养24h后，用4%多聚甲醛／0.01m pbs室温下固定60min，余下步骤按试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 5f对nci?h460细胞生长的抑制作用

从表1和图2的结果可以看出，5f能明显抑制nci?h460细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用细胞48h后效果与阳性对照药adm相近。5f作用nci?h460细胞24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml。

2.2 荧光显微镜观察5f对nci?h460细胞的影响

经pi?hoechst双染的nci?h460细胞， 对照组细胞核大小较均一， 呈圆形或椭圆形， 染色质分布均匀， 此外光下显蓝色荧光， 出现个别坏死细胞， 见图3a。 而经5f处理24h后的nci?h460细胞细胞形态则出现不同程度皱缩， 变形， 染色质浓缩， 部分细胞核染色体碎裂， 并有凋亡小体出现， 见图3b～d。 且细胞凋亡形态出现的多少与5f的浓度相关。

2.3 流式细胞仪检测细胞dna的变化

5f作用细胞24、48h后nci?h460细胞的dna含量发生变化。随着5f作用终浓度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出现含量降低，s期表1 5f对nci?h460细胞的生长抑制作用表2 5f处理nci?h460细胞不同时相dna含量的影响变化不明显，g2/m显著增加。提示5f可以将nci?h460细胞阻滞在g2/m期，见表2。

2.4 tunel法检测5f对nci?h460细胞凋亡的影响

tunel法检测显示正常对照细胞不显深棕黄色,而经5f处理后的细胞胞核呈深棕黄色，表现为形态皱缩,核固缩,凝集成块，并形成凋亡小体，其凋亡数与5f剂量呈正相关，见图4。

3 讨论

临床上用于治疗肿瘤的热疗、放疗、化疗及生物疗法一直被用于杀死肿瘤细胞，随着肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈进，尤其近十几年迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望，但目前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺进行了详细的研究[4?6]，多年的实验证实其二萜类提取物5f 在体外可致人的多种癌细胞死亡，主要作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁移[7?9]。

细胞凋亡(apoptosis)是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。凋亡细胞的特征是细胞体积缩小，随即与邻近细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质浓缩呈块、团，典型的为半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结构，内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的[6]。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。

细胞的生长增殖，24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f对其的生长抑制作用呈浓度－剂量及时间－剂量关系；荧光双染的结果显示经不同浓度的5f处理24h后的nci?h460细胞细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，细胞凋亡形态出现的数量与5f的作用浓度有关,这提示5f体外对nci?h460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡有关；流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在g2/m期，但5f终浓度为40μg/ml时，细胞周期各时相均出现不同程度的改变，这可能与高浓度5f直接杀伤细胞，表现出细胞毒作用有关；进一步用tunel法进行凋亡检测证实了5f抑制nci?h460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示5f具有诱导nci?h460细胞凋亡的能力，是一种值得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。

【参考文献】

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［7］ 何太平，覃燕梅，莫丽儿，等. 半边旗二枯类化合物sf对高转移卵巢癌ho ?8910pm细胞中癌相关基因表达的影响[j]. 中国药理学通报，2008， 24（1）：117?122.

生物细胞作用例4

目的 增加细胞膜色谱法的适用范围，构建血管内皮细胞细胞膜固定相，研究药物与血管内皮细胞膜上受体的生物亲和作用。方法 培养血管内皮细胞细胞株，制备细胞膜固定相，应用细胞膜色谱法研究九种药物与受体的亲和力。结果 九种不同的配体与受体的亲和顺序为：S(+)QNB、哌唑嗪、R(-)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、山莨菪碱、东莨菪碱。其容量因子分别为：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。结论 血管内皮细胞膜色谱模型具有高度稳定性，可试用于药物的高效初筛。

【关键词】 细胞膜 色谱 血管内皮细胞

ABSTRACT: Objective To extend the application of cell membrane chromatography (CMC)， the cell membrane stationary phase (CMSP) with human umbilical vein endothelial cell (EVC304) are constructed. The chromatography affinity of drugs to receptors of EVC304 is investigated. Methods We cultured EVC304 strain and constructed EVC304 CMSP. The bioaffinity of nine drugs to receptors was investigated per CMC method. Results The affinity rank order of receptors obtained from CMC for the nine ligands was as follows: S(+)QNB， prazosion， R(-)QNB， atropine， yohimbine， BMY7378， metoprolol， 6542， and scopolamine. The related kvalues were 14.289， 13.667， 11.121， 6.794， 4.758， 4.386， 3.926， 2.424， and 2.412. Conclusion The EVC304 expressed CMSP has high stability and can be used to speed up the initial screening.

KEY WORDS: cell membrane; chromatography; vascular endothelial cell

细胞膜色谱法(cell membrane chromatography， CMC)是以固定在硅胶表面的细胞膜为固定相，通过药物在固定相上的色谱行为有效地将药物的体内过程在体外进行模拟[13]。此法已被证明可用于研究药物与受体的相互作用和中草药中生物活性成分的筛选[46]。但是，用CMC法研究受体和筛选药物时，有时所需标本量太少并难以收集，还不能进行血管内皮细胞等散在分布细胞的研究和药物的筛选。为了增加CMC法的应用范围，本实验将CMC法与细胞生物学方法相结合，用人脐静脉血管内皮细胞ECV304制备细胞膜固定相(cell membrane stationary phase， CMSP)，建立了血管内皮细胞膜色谱模型，用CMC法首次研究了9种配体与内皮细胞上受体的生物亲和作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞

来源于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)的人血管内皮细胞株EVC304，由中国科学院上海细胞研究所提供。

1.1.2 药品

阿托品(Atropine，分子量289.4)购自上海化学试剂采购供应站；R(-)QNB(分子量337.38)、S(+)QNB(分子量337.38)均购自RBI公司；东莨菪碱(Scopolamine，分子量384.3)、育亨宾(Youhimbin，分子量390.9)、BMY7378(分子量458.4)、哌唑嗪(Prazosin，分子量419.9)、(±)美托洛尔(Metoprolol，分子量267.38)均购自Sigma公司；山莨菪碱(6542，分子量386.29)购自山西晋西双鹤药业。

1.1.3 主要试剂

DMEM干粉培养基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、NaCl、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器

Gilson高效液相色谱系统，包括510泵、486型紫外检测器、7125型手动进样阀(美国Rheodyne)和Anastar色谱工作站(天津奥泰科技有限公司)；410型低温冷冻高速离心机(德国HERMLEZK)；AS5150A超声振荡仪(美国Auto science)；PHS2D型酸度计(上海第二分析仪器厂)；TB85型循环水浴(日本SHIMADZU)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

来源于人血管内皮细胞株ECV304，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下，培养于含100mL/L小牛血清DMEM培养基中，常规传代[7]。

1.2.2 EVC304细胞膜的制备

当8个培养瓶(75cm2)的内皮细胞覆盖瓶底90%时，将其中4瓶做细胞膜。另外4瓶细胞冻存于液氮罐中保存。制膜方法：2.5g/L胰蛋白酶液消化，1000×g离心10min，弃上清，加入10mL低渗液，超声振荡20min，450×g离心20min，取上清液，16000×g离心20min，取沉淀为ECV304细胞膜，上述操作在4℃下进行。

1.2.3 EVC304细胞膜色谱柱的制备

取活化硅胶(5μm)0.3g，加入上述制备的ECV304细胞膜，4℃振荡60min，平衡后离心分离，沉淀物用0.6mL TrisHCl洗涤后，为ECV304细胞膜固定相。由药学系天然药物研究与工程中心提供。比较两个同种细胞膜色谱柱的稳定性。

1.2.4 9种配体对EVC304细胞膜CMC的研究

柱温为37℃；流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(Na2HPO4)，pH＝7.4；流速为0.5mL/min；色谱柱需用流动相平衡3～4h，基线稳定后，分别进样分析；紫外检测波长为220～270nm(根据每种药物实测情况定)；灵敏度(AUFS)为0.2。

1.3 统计学处理

用Prim软件对药物在两个CMSP上的容量因子(K＇)进行相关性分析，取检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 内皮细胞形态学观察

倒置显微镜下可见培养的单层生长的内皮细胞为长梭型，边界清楚，胞浆丰富，核圆形或椭圆形，核仁1～2个。人脐静脉内皮细胞生长到融合状态时，呈“铺路石”状排列。

2.2 9种药物的CMC研究结果

将EVC304细胞膜色谱柱用50mmol/L磷酸盐缓冲液平衡3～4h后，根据九种药物紫外检测波长测定结果(220～270nm)分别进样分析。其中山莨菪碱(6542)为注射用针剂，规格为10g/L，用三蒸水配成浓度为3×10-3mol/L。其余药品均为白色固体粉末，用甲醇溶解，浓度均为3×10-3mol/L。计算不同药物在内皮细胞色谱柱上的容量因子K＇(表1)。药物在另一个EVC304细胞膜色谱柱上的亲和力研究方法同上(表2)。表1 药物在第一个EVC304细胞膜CMSP上的色谱作用参数（略）表2 药物在第二个EVC304细胞膜CMSP上的色谱作用参数（略）

不同mAchR、αAR、βAR阻滞剂在第一个内皮细胞CMSP上亲和力顺序由大到小为：S(＋)QNB、哌唑嗪、R(－)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、山莨菪碱、东莨菪碱。其容量因子分别为：14.289、13.667、11.121、6.794、4.758、4.386、3.926、2.424、2.412。药物在第二个EVC304CMSP上亲和力顺序由大到小为：哌唑嗪、S(＋)QNB、R(-)QNB、阿托品、育亨宾、BMY7378、(±)美托洛尔、东莨菪碱、山莨菪碱。其容量因子分别为：10.734、9.398、9.177、7.964、5.585、5.369、4.061、2.931、2.472。

2.3 药物在两个CMSP上的容量因子(K＇)相关性分析

根据同种药物在两个EVC304细胞膜色谱柱上容量因子的检测结果，用Prim软件进行相关性分析，结果表明药物在两个同种色谱柱的容量因子之间存在正相关关系(r=0.966)，且差异具有显著性意义(P

3 讨 论

人脐静脉作为培养内皮细胞的材料来源，具有取材方便，且能使实验结果更接近人体内皮细胞生长等优点。经体外培养的人脐静脉内皮细胞，不仅在形态和功能上与体细胞相似，还能在数量上呈几何级数增加，这为研究与内皮细胞有关的基础及临床医学课题提供了理想的细胞模型。本次实验首次研究了9种药物在内皮细胞CMSP上的保留情况。ECV304是由人脐静脉内皮细胞转化的细胞系，可以表达内皮细胞标志如WeibelPalada小体、纤溶酶原激活物(plasmiaogen activator， PA)等，它可以进行稳定传代培养，是原代内皮细胞培养的良好模型。

在实验过程中，为保证比较结果的可靠性，要做到：①细胞膜制备方法保持一致。细胞膜制备在0～4℃进行，制备好后立即使用。②培养细胞的数量尽可能保持一致。两个CMC色谱柱所用的细胞膜均来自4瓶培养细胞(75cm2)。③实验条件要保持一致。本次实验流动相均选择37℃，50mmol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液。因为随着流动相浓度的增加，洗脱能力增加，药物的保留时间缩短，容量因子减小。条件不一致数据没有可比性。

实验选用的药物有mAchR拮抗剂：阿托品、山莨菪碱(6542)、东莨菪碱和QNB。QNB是目前最强的毒蕈碱受体拮抗剂，是理想的M胆碱受体鉴定工具药。哌唑嗪和BMY7378是α1AR拮抗剂；育亨宾是α2AR拮抗剂；美托洛尔是βAR拮抗剂。实验药物在第一次制备的内皮细胞CMSP上的容量因子与第二次实验结果略有不同，原因是所用的高效液相色谱仪仅有一台，不能同时研究两个色谱柱。第二次所用细胞经过液氮罐冻存，细胞有损失，使得药物在色谱柱上的保留时间缩短。但药物在两个内皮细胞CMSP上的容量因子之间存在正相关关系(r=0.966， P

本次实验也证明了EVC304上存在M受体、α1AR、α2AR、βAR，其中βAR数目相对较少。用培养细胞制备CMSP后色谱柱的手性识别能力并没有提高，左旋和右旋QNB在色谱柱上的保留时间相差1min左右，消旋体美托洛尔没有被分开。随着CMC研究工作的一步步深入，其应用范围将逐步扩大，使之更符合药物作用的体内过程。CMC法将以快速、高效等特点成为受体研究和中草药筛选的新方法。

参考文献

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生物细胞作用例5

[中图分类号] R782.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）15-0053-03

溶胶-凝胶生物活性玻璃是一种含有硅、钠、钙和磷等成分的透明生物活性材料[1]，医用开发的生物活性玻璃具有与天然骨类似的组成，生物相容性好，可与生物组织产生直接的化学结合，植入人体后可参加新陈代谢使骨组织生长，是一类可以与骨组织良好键合的骨修复材料[2]。已发现生物活性玻璃能够促进人成骨细胞增殖[3]。

磁力在20世纪70年代后期被引入正畸学领域以来，就备受关注[4]。研究表明， 0.062 T的静磁场可以促进成骨细胞的增殖[5]。由于以往多为单独研究生物活性玻璃或静磁场对成骨细胞的影响，本研究初次探讨静磁场结合溶胶-凝胶生物活性玻璃同时对成骨细胞的作用，观察成骨细胞在两者共同作用下的增殖性，推断其对牙槽骨改建的潜在影响[6]，为正畸临床医生矫治错畸形患者寻找更好的治疗方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 静磁场的设计 参考仇丽鸿等[7]的方法，将两块钕铁硼永磁体（15 cm×9 cm×2 cm）充磁后分别固定于特制的长方形盒子（15 cm×9 cm×2 cm）内。在长方形盒子的间位置可放置96孔细胞培养板，调节96孔细胞培养板及两块钕铁硼永磁体之间的位置关系， 应用特斯拉测定仪测定培养板底部的磁场强度， 使其磁场强度为 0.062 T。

1.1.2 生物活性玻璃 采用溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S，由华南理工大学材料学院提供。

1.1.3 实验细胞 Wistar大鼠成骨细胞株由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶胶-凝胶生物活性玻璃的配制 将粉末状的溶胶-凝胶生物活性玻璃 58 S高温高压灭菌后，按1 mg/mL浓度配入培养基，静置24 h后，用0.22 μm过滤膜过滤，最后将其浸提液按1：9稀释10倍待用。

1.2.2 分组方法 复苏Wistar大鼠成骨细胞株，并传代培养至第4代后随机分为四组： ①空白组：成骨细胞培养组；②溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞细胞生长组；③静磁场作用下成骨细胞实验组：0.062 T静磁场作用下成骨细胞生长组；④静磁场作用下溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：0.062 T静磁场作用下，溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞生长组。

1.2.3 细胞增殖（MTT）的测定 用含 5%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 104个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 μL，每个样本做 3 个复孔。37℃、5 mL/L CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h、120 h。每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL用 PBS 配制，pH=7.4）20 μL。继续孵育4 h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液。每孔加 150 μL DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0 统计软件处理。差异分析应用方差分析和t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1。随着细胞培养时间的增加，各组细胞出现不同程度的增殖，通过任意两组组间比较t值在24 h、48 h、72 h、120 h时间点的比较，可知四组间成骨细胞在24 h、48 h、72 h、120 h各个时间点的增殖性存在显著性差异。本研究结果表明，与空白组相比，三个实验组的增值率在48 h之前均呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h达到最高点；并且成骨细胞的增殖率在48 h时，58 S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组最高。

3 讨论

随着生物磁技术与人工材料的发展，有关磁场、人工材料作用与生物学效应的研究，取得了积极的成果，各类磁场强度治疗及生物活性玻璃在医学中的基础和临床应用研究越来越广泛。但是有关静磁场和生物活性玻璃对骨组织作用和相关代谢机制的研究较少[8]。课题组首次应用体外研究探讨静磁场加生物活性玻璃同时对成骨细胞增殖的影响，为今后进一步基础及临床研究打下基础。

本研究结果表明，与空白组相比较，0.062 T磁感应强度的静磁场、溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S、以及二者共同作用，在这三种因素作用下，成骨细胞增殖率均在48 h之前呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h时达到最高点；58S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组的成骨细胞增殖率在任何时间点均高于其余三组。由本实验研究可得出，磁感应强度为0.062 T的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S相互协调、共同作用，对成骨细胞的增殖起到相互加强的作用。

成骨细胞不仅是骨形成的主要效应细胞，而且对破骨细胞的分化和成熟具有重要调控作用，因此在骨改建的过程中处于一个中心调控的地位。牙-牙槽骨独特的生物学特性是正畸牙得以移动的基础。0.062 T磁感应强度的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58 S相互协调、共同作用时，更强地促进成骨细胞的增殖。而增殖是生物体最根本的生命活动，对于骨缺损、骨吸收等骨性疾病，促增殖作用显得尤为重要，由此静磁场加生物活性玻璃可更好地促进牙槽骨的改建，这为今后静磁场加生物活性玻璃在临床正畸治疗上的应用研究奠定基础。

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生物细胞作用例6

[关键词] 藤梨根/猕猴桃根；食管肿瘤；抑制；凋亡

Abstract:Objective To evaluate the inhibitory effect of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on human carcinoma of esophagus cells(Eca-109).Methods MTT colormetric assay was used to examine the growth inhibition of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on Eca-109 cells， TUNEL test was performed to observe the apoptosis induced by the extracts (1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)on Eca-109 cells. Results ① The inhibitory effect of the extracts on Eca-109 cells was increased in a dose-and time-dependent manner. ②The extracts could significantly induce apoptosis of Eca-109 cells. Conclusion The extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol could effectively inhibit Eca-109 cell growth.

Key words: Tengligen/actinidia arguta; Esophagus tumor; Inhibitory effect; Apoptosis

细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序性死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现细胞凋亡在许多疾病尤其在肿瘤的发生、发展及转归中起着重要作用，这为肿瘤病人的治疗提供了新的思路。随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观察及实验研究的深入，人们逐渐肯定了它对肿瘤治疗方面的疗效。其抗肿瘤作用机制有多方面，如抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨（软枣猕猴桃）Actinidia arg-uta(Sieb.teZucc.)Planch.或猕猴桃A.chinensis Planch.的根。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，采用不同方法所得的提取物其抑制作用存在一定的差异[5-6]。本文通过观察藤梨根对培养的人食管癌Eca-109细胞生长的作用，以探讨藤梨根对人食管癌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人食管癌细胞Eca-109细胞株购于上海市中科院细胞库，RPMI-1640培养基购于武汉天源生物技术有限公司，为Gibco公司产品(货号31800-022)；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品(批号050126)；实验用1∶250胰酶购于武汉天源生物技术有限公司，为Difco公司产品(批号020411)；四甲基偶氢唑蓝(MTT) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Duchefa分装(货号BS0880)；二甲亚砜(DMSO) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Sigma公司产品。TUNEL试剂盒(编号ZK-8005) 购于北京中杉生物技术有限公司。

1.2 细胞培养细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h换液一次。

1.3 药物制备将藤梨根1 kg粉碎成粗粉，烘干备用。取藤梨根500 g，加入3 000 ml正丁醇中浸泡12 h；回流提取1 h，过滤；药渣再加2 000 ml正丁醇回流提取1 h；合并两次滤液，减压回收正丁醇至稠膏状，真空干燥；干燥品加蒸馏水500 ml，旋转加热溶解，制成饱和水溶液；灭菌；原液(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)。将原液稀释成1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml三个药物浓度；过滤；灭菌；分装，置4 ℃冰箱备用。

1.4 MTT法将贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇提取物药液。实验组分别加入终浓度为1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml 3个药物浓度的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每组l2复孔，分别于加药后第1、2、3 d测定各孔的吸光度值(A值)。测定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，温育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl /孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定A490值。用各组的平均A值计算细胞生长抑制率。生长抑制率=（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。

1.5 TUNEL法检测凋亡细胞将浓度为4×104/ml的Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的干净盖玻片上，用RPMI 1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下在24孔板中培养24 h后取出盖玻片，PBS冲洗3次。0.1%Triton-100破膜、4%多聚甲醛固定，H2O2阻断。用TDT法将生物素标记的d-UTP在末端转移酶的作用下，标记到DNA的5′端缺口上，再用亲和素标记的HRP与之结合，然后加入底物DAB显色，苏木素复染，从而使凋亡细胞核呈现棕褐色，未凋亡细胞核呈蓝色。在光学显微镜下随机计数5个高倍视野约1 000个细胞中的凋亡细胞数， 计算凋亡细胞所占比例。

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2 结果

2.1 MTT法检测生长抑制率结果表明藤梨根正丁醇提取物对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，细胞生长抑制率为18.5%；当延长至72 h时，抑制率上升至45.3%；而100 μg/ml的药物作用72 h时，可使85%以上的细胞生长受到抑制（见表1）。

表1 藤梨根正丁醇提取物对Eca-109细胞的生长抑制率（略）

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡当用1 μg/ml藤梨根正丁醇提取物处理Eca-109细胞24 h时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞；当药物作用时间延长至72 h时，可见凋亡细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成新月形，此为晚期凋亡细胞，随时间的推移，凋亡细胞比例逐渐增加（见图1）。而对照组，未见有明显凋亡现象（见图2）。

3 讨论

肿瘤是危及人类生命的首要顽疾，药物治疗为中西医肿瘤治疗中的一个重要模式，包括化学药物和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其机制有多方面，如抑制DNA合成、抑制肿瘤血管形成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、调节机体免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。关于藤梨根的研究已有报道，其对消化系统肿瘤有良好的抗肿瘤作用，可用于消化系统肿瘤的治疗[5]，但其抗肿瘤作用机制还不清楚。初步研究发现，同种猕猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同。有学者用甲醇、水、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂回流提取， 观察提取物对同种肝癌细胞株的作用， 结果表明正丁醇、乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有较好的抑制作用， 但各组量效关系不明显[6]。关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成分， 曾有人报道主要为三萜类化合物， 分别为乙酸乙酯提取物熊果酸、β-谷甾醇及正丁醇提取物2α，3α，24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、2β，3β，23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、24-hydroxytormentric acid[7]。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。钟振国[8]等采用MTT比色法、集落形成法等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株Hela、神经肿瘤细胞株NG108-15、胃癌细胞株SGC7901等进行了研究，结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用。李昊[9]等研究了藤梨根对人胃低分化腺癌BGC-823细胞的作用，发现其浓度在1.3 mg/ml时抑瘤率最强(88.19%)，随着药物浓度的降低，抑瘤率随之下降；藤梨根对胃癌细胞作用24 h抑制作用最强(87.6l%)，48 h回落，72 h再次上升， 其对胃癌细胞有明显杀伤作用。卫培峰[10]等在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋亡， 与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异。 近几年来，国内外对细胞间隙连接通讯与癌变的关系进行了大量的研究，发现多数肿瘤细胞无此功能，其间隙连接少或无，而邻近的正常组织或良性肿瘤的间隙连接正常，少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯，但很容易受到破坏，其间隙连接数量很少，藤梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长[11]。本研究结果证实：藤梨根正丁醇提取物三个药物浓度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109细胞24 h、48 h、72 h后，显示出明显的凋亡特征。TUNEL法可检测到不同时期的凋亡细胞；MTT法也发现随药物浓度升高和作用时间的延长，其抑制率明显升高。因此推测，诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调控及信号传导极其复杂，有多种分子参与。故抗肿瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验尚需进一步深入研究。

(文中图1~2见封四)（略）

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[10]

生物细胞作用例7

【关键词】 巨噬细胞; γ射线; LPS; S100A8

巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用， 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常， 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性， 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitric oxide， NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志， 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变， 但0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ， IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导生成NO， 而且呈现剂量效应关系［1］。

钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员， 是一个多功能分子， 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现， 6 Gy X射线照射MCF7细胞后48～72 h， S100A8被诱导表达， 其 mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8， 激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子， S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达， 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中， 电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、 周期、 活性氧介质（reactive oxygen intermediates， ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 试剂LPS、 2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2， 7dichlorofluorescin dictate， DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide， PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、 MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit为杭州博日公司产品。FACS Calibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 37℃、 50 mL/L CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24 h， 换新鲜培养基， 不辐射或10 Gy 60Co γ射线照射， 照射后24 h， 不加或加入5 mg/L LPS， 继续培养24 h。相差显微镜观察细胞形态变化。

1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液， PI染色， 流式细胞仪检测， 具体按文献［5］进行。

1.2.3 流式细胞术测定ROI水平 约1×106 RAW264.7细胞铺种于6孔板中， 培养过夜， γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞， 用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后， 20 μmol/L DCFHDA悬浮细胞， 37℃孵育30 min， 无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后， 0.5 mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞， 流式细胞仪检测。

1.2.4 NO水平检测 通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平， NO-2水平以吸光值A550表示， 具体方法参照文献［1］进行。

1.2.5 实时定量RTPCR检测S100A8表达 用 TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA， 经紫外分光仪检测A260和A280， 测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg， 随机引物0.5 μg， M MLV逆转录酶200 U， 进行25 μL体系反转录。每PCR反应取2 μL反转录产物为模版， 加入BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit试剂， 于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshhold cycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′， 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′， 下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法， 以看家基因GAPDH为内参， 以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8 mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-CT)， 其中CT=γ射线或(和)LPS处理样品的CT -正常对照的CT， CT=S100A8的CT-GAPDH的CT 。

1.2.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示， 应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。

2 结果

2.1 RAW264.7细胞形态学改变 观察比较RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化， 可见正常RAW264.7细胞为圆形， 贴壁生长; 单纯γ射线或单纯 LPS处理的细胞变大， 部分细胞伸出伪足、 呈梭形， 胞内颗粒增多， 两种处理细胞形态学改变类似; γ射线与 LPS共同作用的细胞变得更大， 胞内大量颗粒物， 巨噬细胞呈现被激活状态。

2.2 RAW264.7细胞倍性、 凋亡的改变 正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、 凋亡细胞百分数均为0%; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， 细胞均出现部分非整倍性细胞; 而只在γ射线与LPS共同作用条件下， 细胞才出现明显凋亡（图1）。

2.3 RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变 观察10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的动态变化， 照后即刻开始升高， 6 h达高峰， 24 h基本恢复到正常水平（图2）， 可见胞内ROI早期生成明显， 随后下降， 因此我们比较细胞受各种处理后6 h， 胞内ROI水平的改变。单纯10 Gy γ射线照射后30 h（即10 Gy γ射线照射后24 h， 0 mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平不变; 单纯5 mg/L LPS处理后6 h（即0 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理6 h， 胞内ROI水平明显升高， 从测定数值看， 明显高于单纯5 mg/L LPS处理后6 h或单纯10 Gy γ射线照射后胞内ROI的水平（图3， 图2）。图2 10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的变化

2.4 RAW264.7细胞NO水平的变化 单纯γ射线照射， 胞内NO水平不变; 单纯LPS处理条件下， 与正常对照相比， 胞内NO水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h， 胞内NO水平明显升高， 而且高于单纯LPS处理组， 表明γ 射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。

2.5 RAW264.7细胞中S100A8 分子mRNA表达水平的改变 实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8 mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 单纯10 Gy γ射线处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为9.0±2.3; 单纯5 mg/L LPS处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为86.0±8.3; 10 Gy γ射线与5 mg/L LPS共同作用条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为630.0±70.8。可见， γ射线、 LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8 mRNA表达， LPS的作用强于γ射线， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。

3 讨论

我们的研究表明， RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h条件下， γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应， 具体表现为细胞体积明显变大， 胞内大量颗粒物， 呈现被激活状态; 部分细胞呈现非整倍性， 少量细胞出现凋亡; 胞内ROI水平、 NO水平明显升高; S100A8 分子mRNA水平明显升高， 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。

γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变， 胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40 Gy γ射线照射后0～72 h细胞倍性、 周期、 凋亡的改变， 发现随时间、 剂量不同， 细胞周期呈动态改变， 但细胞几乎不出现凋亡， 只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡， 一定程度说明细胞具有辐射抗性; 部分细胞呈现非整倍性， 而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍， 非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、 细胞功能的改变或细胞分化状态相关。

ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40 Gy射线照射后6 h， RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势， LPS能引起胞内ROI水平升高， 而且 射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明， 0～10 Gy γ射线照射后24 h， RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在 射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中， 第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。

S100A8能够为辐射诱导表达， 紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达， ROI参与了此过程［7］。此外， 大鼠肝部受20 Gy射线照射后6 h S100A8蛋白水平升高， 而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现， 单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， RAW264.7细胞中S100A8 mRNA水平升高， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达， 未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化， 这与已有报道的研究结果一致［3， 4， 7， 8］， 说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明， ROI及转录因子激活蛋白1(activator protein1， AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关， 那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外， S100A8/A9复合物及S100A8、 S100A9具有抑制细胞增殖、 诱导细胞凋亡的功能［9］， γ 射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、 引起该细胞凋亡， 两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。

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生物细胞作用例8

【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent， 5Aza2′deoxyctidine (5AzaCdR)， on the proliferation， cell cycle， apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentrations of 5AzaCdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semiquantified by RTPCR before and after 5AzaCdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dosedependent manner after exposure to 5AzaCdR at different concentrations (1×103， 5×103， 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells ［(4.53±0.21)%， (8.11±1.01)%， (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5AzaCdR for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%， P

【Keywords】 5AzaCdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(BIR)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspase活性最强的成员. XIAP相关因子1(XAF1)是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转XIAP对细胞的保护. XAF1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，XAF1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5AzaCdR对胃癌细胞株进行处理， 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及治疗的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌BGC823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5AzaCdR（美国Sigma公司）；配制5AzaCdR为1 mol/L的母液，-20℃保存，使用时用RPMI1640稀释为工作浓度. Tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(BioTek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(Beckman Coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于RPMI1640培养液中，内含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mg／L链霉素和2 mmol/L L谷氨酰胺，置于37℃ 50 mL/L CO2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化BGC823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μL)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR药液的完全培养液，每孔100 μL，每组设3个复孔；对照组加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线，计算细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR(％)=(1-实验组A470 nm均值／对照组A470 nm均值)×100％.

1.2.3 RTPCR检测xaf1基因mRNA表达 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，Trizol一步反向法抽提细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定RNA纯度，A260 nm／A280 nm在1.8～2.0之间. PCR引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；Sense：5′TGGGTGTAGGATTCTCCAGG3′，Antisense：5′GGTTTGCCCAAGGACTACAA3′. 内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；Sense：5′TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3′，Antisense：5′GTACATGGTATTCACCACCC3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法RTPCR：① 逆转录反应：20 μL反应体系含：2 μg模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNasefree ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L AMuLV RT. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μL反应体系含：cDNA 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，Tap酶0.5 μL，上下游引物各1 μL，去离子水补至50 μL，GAPDH作内参照. PCR仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相对定量.

1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1×109个／L，700 mL/L冷乙醇－20℃固定24 h，加RNaseA至终浓度1 g/L，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／L，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 5AzaCdR对细胞增殖的影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理6 d后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的CPIR值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（P

bP

图1 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后的生长曲线（略）

2.2 5AzaCdR对细胞中xaf1基因mRNA表达的影响 5AzaCdR处理前BGC823细胞系的xaf1基因mRNA不表达，在经5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理后，xaf1基因mRNA重新表达，10×103 nmol/L的5AzaCdR处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3 5AzaCdR对细胞周期的影响 BGC823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理72 h后，S期的细胞数量逐渐增加，G2/M期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h.

图2 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后GAPDH mRNA的表达（略）

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后xaf1 mRNA的表达（略）

表1 BGC823细胞经5AzaCdR处理72 h后细胞周期的变化（略）

aP＜0.05， bP＜0.01 vs对照.

3 讨论

DNA甲基化是由S腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5甲基胞嘧啶(5mC)的化学修饰过程［3］. 近期研究表明，多种人类肿瘤在发展过程中表现异常DNA甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域CpG岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的CpG岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/L)的特异性DNMT抑制剂5AzaCdR，对体外培养的胃癌BGC823细胞进行干预，RTPCR结果显示在5AzaCdR作用前，xaf1 mRNA不表达，而在5AzaCdR作用后，xaf1 mRNA又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明DNA甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5AzaCdR人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化治疗肿瘤提供了理论基础.

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们应用不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5AzaCdR诱导胃癌BGC823细胞后，MTT结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期分析可见S期的细胞数逐渐增加，G2/M期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于S期，而使得进入G2/M期的细胞减少，由此推断5AzaCdR的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制XIAP对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(IFN)诱导基因，其介导了IFN诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

参考文献

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生物细胞作用例9

合作学习（cooperative learning）是一种以小组学习为形式，旨在促进学生合作，从而达到最佳学习效果的教学方法。它能改善课堂气氛，大面积提高学生的学业成绩，并且能满足学生的心理需要，促进学生情感的发展，已经广泛地受到世界各国的青睐，并成为当代主流教学模式，被越来越多的教师所认可并采用。

医学细胞生物学是我院大一新生第一学期开设的课程。由于医学细胞生物学是一门重要的医学基础课程，且为后续其它的基础医学和临床课程的学习搭建牢固的知识平台，因此，熟练掌握其基础理论、基础知识和实验技能，对医学院的学生来说十分必要。

一、合作学习教学模式的必要性

1.生物学基础知识参差不齐。

我院生源不统一，如护理、预防专业，招收的高中文、理科毕业生皆有，因此刚接触学习医学细胞生物学时，文科毕业生不太习惯这种知识体系，对学习医学细胞生物学相对倦怠和恐惧，容易产生抵触学习情绪，很大程度地影响了学习成绩。

2.传统的教学模式已经不适用于新兴人才的培养。

传统的以教师为“绝对中心”、滔滔不绝的“填鸭式”教学法，使学生失去以饱满状态进行持续听取整堂课的兴趣，学习气氛沉闷，学生学习的积极性和主动性得不到充分的调动和发挥，教学效果不敬人意。

合作学习教学模式以面向全体学生为原则，不仅有利于促进每个学生的发展，而且突出教学过程中学生的主体地位，能够充分调动学生的学习积极性，增强学生的学习效果和教师教学的实效性。因此在医学细胞生物学的教学中，以合作学习教学模式作为对传统教学模式的一种突破和补充，是十分必要的。

二、合作学习教学模式在医学细胞生物学课程中的应用

合作学习模式是一种责任分工学习模式，也是一种互助学习模式，是教师营造民主、平等的学习氛围，通过生生互动、师生互动的交流方式，充分发挥学生的主观能动性和学习潜能，齐心协力共同完成教学目标的一种教学模式。该模式由以下几个步骤构成。

1.学生自主合理划分小组，以小组为单位收集资料（课前）。

合作学习以学生为中心，其基本教学形式是小组活动。分组采取自愿原则，但必须兼顾“组内异质，组间同质”，即按照性别、兴趣爱好、知识基础、语言能力和学习能力等特征将整个班级平均分成若干组，每组6―8人。每组设一个组长，负责工作。组长可以由组内成员轮流担当。组内成员有男有女，有文有理，有强有弱。这样互补型的组内成员优化组合，不仅能使学生产生新鲜感，而且能增强学生的学生兴趣。

组内成员课前各自预习即上新内容（如小分子的跨膜运输），并相互协作通过课本、互联网、图书馆等途径收集即上新内容的相关资料，达到预习的功效。

2.教师课堂进行班级集体授课，制订教学目标（课堂20min）。

合作学习教学模式中的班级集体授课，是合作学习的一种前提准备，也是合作学习模式策略中必不可少的一个重要环节。在集体授课中，教师需要解决的任务有以下几个。

（1）激发兴趣。教师在计划时间内，高效讲授新的课程内容的基本点，以积极、振奋、饱满的情绪感染学生，用影视、图像、声音、动画与文字等多媒体信息进行授课，如各种小分子跨细胞膜膜转运的动画素材，感染学生的听课情绪，激发学生的听课兴趣。

（2）目标设计。做好合作学习的启动工作，根据讲授内容抓住重、难点，按照“从大到小”的原则提出在学生能力范围内的可操作性问题。如：“细胞膜是不是完全封闭的结构？”“是不是所有的小分子跨膜运输都需要膜转运蛋白?”“小分子跨膜运输都需要消耗ATP吗？”“小分子物质的跨膜转运主要分为哪两种？”

3.学生小组研究讨论，教师走动观察（课堂15min）。

各小组分别就所提出的问题，根据课前收集的信息和资料进行“主动参与、交流合作”的组内研究和讨论，由组长总结得出的结论。

教师在班级里走动观察各组讨论情况，及时表扬一些好的行为，鼓励一些胆小不爱表达的同学积极发表意见，及时将一些偏离主题的同学拉回正题上来。另外，如有必要，要让学生掌握一些必要的合作技能，如善于倾听别人的意见，在合作学习过程中要学会尊重，如有不同意见，应先保留，等对方讲完，再提出不同的见解。

这样能使每个学生都积极、平等地参与到问题的讨论中来，共同讨论，共同进步，既可以从别人那里获得宝贵知识，对所学知识产生深刻的认识，又能加强语言表达能力和发展人际交往能力。

4.师生共同总结工作（课堂10min）。

先由某一组组长汇报讨论结果，如“小分子跨膜转运主要有简单扩散、协助扩散和载体蛋白耗能介导的运输”。然后其他组组长作出评价和补充，如“简单扩散和协助扩散属于被动运输方式，载体蛋白介导的耗能运输是主动运输方式”。最后教师进行适当的诱导和启发，师生共同对本课所学内容进行归纳总结，达成一致共识，得出结论：小分子跨膜转运按照是否需要消耗能量被分为被动运输和主动运输。

5.建立奖励制度（课后）。

奖励合作学习中表现优异的小组，如分工最为明确的小组、最为团结互助的小组、最具发散思维的小组、最具创新能力的小组、言语最为精炼的小组等，形成“组内成员合作，组间成员竞争”的新格局，使每个同学都加强个人的责任感和团队意识。且每次得优的小组成员都会在平时分上加相应的分数，以资鼓励。

三、结语

合作学习教学模式在医学细胞生物学中的科学、合理应用，有利于学生对完整知识体系的构建，有利于激发学生的最大程度地发挥其主动学习的潜能，有利于学生从他人的思维中获得启发和创新思维，有利于学生培养团结合作的精神，有利于学生整体素质的全面提高，有利于建立和谐、平等的师生关系和生生关系，有利于教师发现自身存在的知识和能力不足，有利于教学质量的不断改进。像这样“师生共同进步、共同分享教育成果”，才是教育的真谛。

参考文献：

生物细胞作用例10

【关键词】 姜黄素及其衍生物;iNOS;NO;LPS;小胶质细胞

姜黄素是从中药姜黄中提取的酚类物质。大量研究表明，姜黄素具有抗炎症、抗氧化、清除自由基等多种生物活性。目前姜黄素衍生物已成为国际新药开发领域的一个研究热点[1]。小胶质细胞是中枢神经系统长驻的巨噬细胞，在中枢神经系统的免疫反应中发挥核心作用。在感染因素如LPS等的刺激下，小胶质细胞被迅速激活。活化的小胶质细胞可诱导蛋白酶的激活，释放各种促炎性细胞因子，并生成大量活性氧和活性氮，iNOS便是其中之一。iNOS一旦被大量表达，其活性便可持续相当长时间，从而大量、持续产生NO，介导广泛的毒性作用，目前认为中枢神经系统炎症病人脑中反应性胶质细胞过度表达iNOS是造成神经元损伤的重要原因[2-4]。本研究对比观察了姜黄素及其衍生物对激活的小胶质细胞NO的释放和iNOS表达的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料 LPS、姜黄素、抗iNOS抗体、抗CD68抗体和抗GAPDH抗体购自Sigma公司;姜黄素衍生物由美国加州大学戴维斯分校邓文斌教授提供;NO测试盒购自美国Cayman Chemical公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小胶质细胞的分离和培养 取1d龄的新生大鼠脑，去除结缔组织和血管，机械捣碎并通过70μm网筛过滤，分离的细胞种植到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，培养于含20%小牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2恒温箱培养，每3d换1次细胞液。2周后，利用摇床振荡法分离纯化小胶质细胞，分离的小胶质细胞培养于含10%小牛血清的DMEM中。

1.2.2 免疫组化方法 小胶质细胞以1×106/孔接种于6孔板，内置无菌盖玻片，培养24 h后，LPS或药物处理18 h(用药物预处理细胞1h后加入LPS，共孵育18h)，吸去培养液，用预冷的PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS漂洗3次;与小胶质细胞特异性抗体抗CD68(1∶200)孵育过夜，然后再用PBS漂洗5 min×3，最后加入荧光Alex-488偶联的辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1000)，室温孵育1 h，PBS漂洗5 min×3，封片，在荧光显微镜下观察，摄片。细胞呈绿色者为阳性细胞，应用J EOR801D 形态学图像分析系统软件，每片随机取4个视野，记录阳性细胞数，与正常无LPS或药物对照组阳性细胞数相比较，计算细胞活性，细胞活性=实验组4个视野平均细胞数/对照组4个视野平均细胞数×100%。

1.2.3 药物处理 将细胞接种于6孔板，分为两个大组，分别为姜黄素组和姜黄素衍生物组。在每一组中，又分为8个小组，分别为无药物/无LPS、无药物/有LPS及不同浓度的药物(包括0.5、1、5、10、25，50μg·mL-1)和LPS组(浓度为1μg·mL-1，用药物预处理细胞1h后加入LPS，孵育18h)。每个点做6个平行，其中3个将做免疫组化分析。重复试验3次。

1.2.4 Western blot 细胞以1×106/孔接种于6孔板，药物处理18 h后，用Western blot分析细胞裂解上清液中目标蛋白的表达。裂解细胞，收集上清液用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS PAGE分离后将蛋白转至Nitrocellular膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜2 h，抗iNOS(1∶500)抗体4℃ 孵育过夜，TBST充分洗涤膜后用二抗(羊抗鼠IgG/HRP，1∶1000)室温孵育1 h，ECL试剂显色成像。以GAPDH作为内参照，即实验组条带强度/对应的GAPDH条带强度。

1.2.5 细胞培养液中NO的测定 应用Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit，按照试剂盒的操作步骤，最后在酶标仪上540nm处测定各孔光密度值(OD)，以LPS组的OD值为对照，计算加药组占它的百分比，即实验组OD值/LPS对照组OD值。

1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，P

2 结果

2.1 免疫组化方法检测细胞活性 发现姜黄素及其衍生物浓度在1μg·mL-1时对细胞活性无明显影响;LPS(1μg·mL-1L)单独作用或与姜黄素(1μg·mL-1)、衍生物(10μg·mL-1)共同作用细胞18 h，对其活性亦无明显影响;但当姜黄素浓度上升到5μg·mL-1、衍生物浓度上升到25μg·mL-1，与LPS共同作用时，细胞活性分别下降了64.49%和44.65%(P

2.2 姜黄素及其衍生物对iNOS表达的抑制作用

在正常条件下，小胶质细胞表达微量iNOS，LPS作用18 h后，iNOS蛋白的水平明显增高，与正常对照组(第一条lane)相比较，差异有统计学意义(P

2.3 姜黄素及其衍生物对NO生成的抑制作用

1μg·mL-1 LPS作用细胞18 h后，细胞培养液中的NO含量增加了70 %，P

3 讨论

大量研究发现，小胶质细胞的激活在很多神经退行性疾病如早老性痴呆、帕金森病等中起着非常重要的作用[5-6]。而小胶质细胞激活后所增量表达的iNOS引起的NO的大量释放，则是介导神经元损伤的一个非常重要的因子。NO作为氧自由基的一种，可刺激细胞，产生兴奋性的谷氨酸，直接损害神经元和少突胶质细胞[7-9];高浓度的NO还可透过细胞膜、线粒体膜，抑制线粒体呼吸链各种复合体的活力;NO与超氧阴离子(O-2)发生快速反应，生成强氧化性的过氧化亚硝基(peroxynitrite，ONOO-)，而引起蛋白质、类脂质及DNA氧化，或分解转化为OH-自由基，对细胞造成不可逆的氧化损伤[10-11]。

姜黄素被证实具有抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤生长等方面的作用，在临床上有着很好的应用前景。尽管姜黄素的临床作用为人们普遍看好，但是其存在溶解性差、易被氧化、吸收率低等缺点。因此，目前以姜黄素为先导化合物合成结构更稳定、溶解性更好、活性更高的姜黄素衍生物已成为国际新药开发领域的一个研究热点。姜黄素衍生物可由黄素分子除去两端含芳环取代基团外为1，6-庚二烯-3，5-二酮结构，此中间结构可视为姜黄素分子的B区，即含有烯键、双羰基和活泼亚甲基等，利用B 区各部位官能团的特点，分别改变其结构类型而合成。本实验中所用的便是其中的一个衍生物。本文通过对比观察姜黄素及其衍生物对LPS激活的小胶质细胞NO的释放及iNOS的表达，来检测姜黄素及其衍生物的抗氧化活性。

本次实验结果表明，姜黄素及其衍生物都能抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的释放，虽然衍生物的活性相对姜黄素来说较弱，提示姜黄素及其衍生物都具有一定的抗炎、抗氧化作用，对于中枢神经系统慢性退行性疾病的预防及治疗有着良好应用前景。

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