关键词：癌 肝细胞 基因治疗 融合蛋白 

摘要：目的构建具有靶向去唾液酸糖蛋白受体、溶酶体逃逸、DNA结合的多功能融合蛋白，并对表达产物进行功能鉴定。方法合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链（GenBank：X02007），退火形成寡核苷酸双链；双酶切含抗去唾液酸糖蛋白单链抗体（ASGPRseFv）c1基因的载体C1／plT2，0．7％低融点琼脂糖凝胶回收C1；以pSW50．Gal4为模板，通过聚合酶链反应（PCR）扩增Gal4基因；采用分子克隆技术将其定向克隆至载体pGC4C26H中，获得重组质粒C1MG／pGC4C26H；双酶切载体C1MG／pGCAC26H，胶回收片段C1MG定向克隆至载体pET-32c中，将含C1MG／pET-32c的B121单菌落1：100接种至1000mlLB肉汤培养基中培养，并通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni“螯合柱亲和纯化，免疫印迹技术（Western blot）和免疫组织化学分析重组蛋白C1MG的抗原结合能力，溶血实验分析C1MG的生物学活性，肿瘤细胞生长抑制实验分析C1MG的DNA结合能力。结果成功构建原核表达质粒C1MG!pET．32e，并经测序证实：在大肠杆菌BL21中有效表达重组融合蛋白C1MG；表达产物以包涵体形式存在；纯化的C1MG大小为64．1kDa，浓度为0．6g／L；Westernblot结果说明C1MG能有效识别重组ASGPR，免疫组织化学结果证实C1MG能结合到鼠肝细胞表面；溶血实验显示C1MG具有裂解红细胞膜功能；肿瘤细胞生长抑制实验证实C1MG将pEBAF／tk-GAL4rec质粒有效地导入表达ASGPR的细胞中并表达TK基因，氯喹对肿瘤细胞生长抑制无明显影响。结论在大肠杆菌中成功表达和纯化得到单链抗体一蜂毒肽一酵母转录因子（C1MG）的融合蛋白，该融合蛋白至少具有以下功能：ASGPR靶向识别能力、溶酶体膜裂解功能、以及DNA特异性结合功能，提示对肝癌的靶向治疗有潜在的应用价值。

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