关键词：骨肉瘤 外泌体 癌相关成纤维细胞 肺转移 肿瘤微环境 

摘要：目的探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体对骨肉瘤侵袭及转移的影响。方法利用人源骨肉瘤细胞株Saos-2采用差速贴壁法分离、培养CAFs,显微镜下观察CAFs的形态,免疫组织化学观察α-SMA蛋白表达对CAFs进行鉴定。培养CAFs,采用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒分离外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态,Western blot检测外泌体特异性标记蛋白β-actin、CD63表达情况对外泌体进行鉴定。培养人源骨肉瘤细胞株Saos-2,分为外泌体组和对照组,采用细胞划痕及Transwell小室实验观察外泌体对Saos-2细胞迁移和侵袭能力的影响。选取一级5周龄BALB/c-nu雌性裸鼠12只,按编号随机分为外泌体组和对照组,每组6只。两组均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右侧背部皮下接种人骨肉瘤Saos-2细胞与Matrigel基质胶混合悬液,建立裸鼠骨肉瘤肿瘤模型。造模结束后即刻进行尾静脉注射:外泌体组每只裸鼠通过尾静脉注射浓度为0.1μg/μL的外泌体悬液30μL,对照组裸鼠尾静脉注射等量生理盐水,两组均1次/周,共注射6次。第1次注射后每日观察裸鼠成瘤情况,从裸鼠右侧背部皮下可触及肿块开始,测量两组裸鼠肿块的最长径和最长径的最大垂直短径,计算肿瘤体积,此后每周测量1次,共测量6次。完成最后一次测量后腹腔麻醉断椎法处死裸鼠,完整取出肿块并称重。取裸鼠肺组织进行切片HE染色观察两组裸鼠肺转移情况。结果显微镜下观察CAFs呈长梭形,排列杂乱,无方向性;细胞免疫组织化学染色结果显示:CAFs的α-SMA蛋白表达阳性,提示CAFs提取成功。电镜观察外泌体呈70~100 nm圆形或椭圆形膜性囊泡状结构;Western blot结果显示外泌体中CD63蛋白呈高表达,β-actin蛋白表达较弱,提示成功分离CAFs来源外泌体。细胞划痕实验、侵袭实验结果显示:外泌体组细胞迁移距离、迁移率、侵袭细胞数目分别为(0.19±0.02)mm、0.81%±0.11%�

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