关键词：山葡萄 克隆 c4h基因 原核表达 遗传转化 

摘要：通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pCC4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50mg/LKan的培养基上对T0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4HcDNA全长1735bp,开放阅读框1518bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性,2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.

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